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发酵罐发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生。重要:如果溶氧低于20％，应该停止甘油或甲醇的补料并且 不做任何提高溶氧的甘油补料阶段将12ml/LPTM1加入50%VVM的甘油中。

1.将补料速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后细胞产量应达到180-220g/L湿细胞，但是不会有重组蛋白质的产生。4％甘油的是所建议的在补料中的****水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。